Лабораторная диагностика: вирус гриппа А (ВГА)

Доступные анализы:

Возможно, будет полезно ознакомиться с отличной информацией, представленной в статье Фила Гогера о гриппе:

Общая патология

• Оценивает наличие поражений тканей, которые могут указывать на наличие заболевания.
• Расположение поражений:
  • Краниовентральная (особенно апикальная и сердечная доли) консолидация

• Проявление может быть диффузным и охватывать несколько областей легкого.
• Может присутствовать некоторый междольковый отек

• Преимущества:
  • Тяжесть поражений может иметь отношение к клинической значимости
• Недостатки:
  • Макроскопические поражения не являются диагностическими (очень похожи на Mycoplasma hyopneumoniae)
  • Часто имеют вторичные или сопутствующие инфекции

Гистопатология

• Оценивает наличие поражений, которые могут подтвердить наличие заболевания
• Типы образцов: легочная ткань
• Проимущества:
  • Некротический бронхиолит обычно считается патогномоничным для инфекции вируса гриппа А у свиней.

    

  • • Характерные поражения появляются через несколько дней после элиминации вируса из организма свиньи, особенно при наличии сопутствующих инфекций.
  Недостатки:
  • Оценка только небольшого образца тканей
  • Неосложненные поражения могут быстро исчезнуть (5-7 дней)

Иммуногистохимия

• Определяет наличие вирусного антигена
• Типы образцов: Ткань легких
• Преимущества:
  • Обнаруживает вирус в месте поражения (хорошее доказательство причинно-следственной связи)
  • Целевой антиген часто является нуклеопротеином, который сохраняется у вирусов гриппа А
• Недостатки:
  • Оценка только небольшого образца ткани
  • Вирус присутствует только в течение короткого периода времени (несколько дней)
  • Требуется присутствие значительно большего количества вируса, чем при ПЦР

Изоляция вируса

• Изолирует живой вирус
• Типы образцов: легочная ткань, бронхиальный альвеолярный лаваж, мазки из носа
• Преимущества:
  • Традиционный золотой стандарт
  • Изолировать вирус для использования при разработке вакцин (аутогенные вакцины) или серологических испытаний (торможение гемагглютинации) для определения перекрестной защиты
• Недостатки:
  • Дорого
  • Долго ожидать результаты
  • Требуются эмбрионированные куриные яйца или клетки почек собак Madin-Darby (MDCK)
  • Процесс инокуляции очень трудоемкий
  • Часто сложно выращивать (много ложноотрицательных результатов)
  • Обработка образцов от поля до лаборатории может повлиять на выживаемость вируса

Полимеразная цепная реакция

• Определяет наличие определенной последовательности вирусной нуклеиновой кислоты (РНК)
• Типы образцов: мазки из носа, ротовая жидкость, легочная ткань, бронхиально-альвеолярный лаваж
• Преимущества:
  • Праймеры могут быть разработаны для воздействия на:
  • • Обнаружение всех вирусов гриппа подтипа А — целевой консервативный нуклеопротеин
    • Обнаружение определенных групп вирусов подтипа: подтип H1, H3, N1 или N2
  • Высокая чувствительность
  • Раннее обнаружение
  • Количественное определение ПЦР может быть связано с наличием поражений
  • Умеренная стоимость
    • Часто можно объединить мазки или образцы тканей, чтобы снизить затраты и свести к минимуму потерю чувствительности (особенно в отношении клинической значимости)
• Недостатки:
  • Высокая чувствительность – особенно в оральных жидкостях, позволяет обнаружить присутствие небольших количеств вируса в поголовье, что затрудняет клиническую интерпретацию результатов относительно степени или тяжести заболевания.
  • Вирус присутствует в организме хозяина только в течение нескольких дней (3–5 дней, особенно в мазках из носа)
  • Нельзя использовать образцы крови или сыворотки для ПЦР-тестирования, поскольку вирус остается в легких и не является системным

Генетическое секвенирование

• Секвенирует генетические сегменты нуклеиновой кислоты (РНК) вируса
• Типы образцов: легочные ткани, мазки из носа, бронхиально-альвеолярный лаваж, ротовая жидкость
• Преимуществаs:
  • Может различать подтипы по многим различным уровням клад
  • • H1: далее делится на клады, обычно именуемые греческим алфавитом (альфа, бета, гамма и т. д.)
    • H3: далее делится на кластеры, обычно именуемые римскими цифрами (I, IV и т. д.)
    • Многие из этих соответствующих кладов или кластеров описаны здесь
  • Может помочь отличить новое появление вируса от существующих или прошлых вирусов
  • Может помочь выбрать штамм вакцины на основе подтипа/оболочки
• Недостатки:
  • Дорого
  • Обычно только последовательность гена H
  • Изменчивость между подтипами/кладами продолжает расти и становится очень сложной

Иммуноферментный анализ (ELISA)

• Определяет наличие антител
• Типы образцов: сыворотка
• Преимущества:
  • ELISAS может быть разработан для:
    • Обнаружение антител подтипа — целевой консервативный нуклеопротеи
    • Обнаружение антител подтипа — целевой специфический гемагглютинин (называемый H или HA) и/или нейраминидаза (называемая N или NA) белки
  • Животные остаются положительными в течение нескольких недель (начинают снижаться через 8-10 недель)
  • Можно использовать в хронических случаях
• Недостатки:
  • Определенные обнаруженные антитела и время обнаружения немного различаются в зависимости от различных доступных коммерческих наборов
  • Требуется от 10 до 14 дней, чтобы стать серопозитивным
  • Невозможно дифференцировать вакцину от дикого типа инфекции
  • Невозможно определить конкретный подтип вируса

Ингибирование гемагглютинации

• Определяет наличие антител
• Типы образцов: сыворотка
• Преимущества:
  • Животные остаются положительными в течение нескольких недель
  • Могут использоваться в хронических случаях
  • Могут использоваться для лучшего определения подходящего времени для вакцинации, избегая вмешательства материнских антител
  • Могут использоваться для определения перекрестной защиты между изолятами
• Недостатки:
  • Каждый анализ специфичен для штамма
  • Требуется изоляция определенного штамма для проверки перекрестной защиты
  • Требуется 10–14 дней, чтобы стать серопозитивны
  • Невозможно дифференцировать вакцину от инфекции дикого типа

Интерпретация результатов

Общая патология

• Положительный: Подтверждение наличия пневмонии
• Отрицательный: Ранние случаи могут не проявляться обширными поражениями легких

Гистопатология

• Положительный: Подтверждение заболевания
• Отрицательный: Отрицательный, или поражения могли быть пропущены, если тестировать неправильный образец или слишком поздно после заражения

IHC

• Положительный: вирус присутствует в месте поражения
• Отрицательный: отрицательный, или вирус мог быть пропущен, если тестирование проводится слишком поздно после заражения или концентрация вируса слишком низкая (присутствует только в течение очень короткого периода времени)

Изоляция вируса

• Положительный: Подтверждение заболевания
• Отрицательный: Отрицательный, вирус мог быть пропущен, если тестирование проводилось слишком поздно после заражения или просто не мог вырасти из-за другого загрязнения или неправильного обращения с образцами (присутствует, но может быть трудно культивировать)

ПЦР

• Положительный: Подтверждение заболевания
• Отрицательный: Отрицательный, вирус мог быть пропущен, если тестирование проводится слишком поздно после заражения или при неправильном отборе или обработке образцов
• Неокончательный: Слишком мало вируса или есть коинфекция более чем одним подтипом

Генетическое секвенирование

• Позволяет идентифицировать подтип и клад вируса
• Позволяет сопоставлять вакцинный изолят для лучшей защиты

ELISA

• Положительный: материнские антитела или воздействие вакцины или вируса дикого типа в прошлом (> 2 недель)
• Отрицательный:
  • Отрицательный результат на вакцину или вирус дикого типа
  • Слишком рано для обнаружения инфекции (10-14 дней до сероконверсии)
  • Несоответствие между анализом и вирусом (подтип или клад

HI

• Положительный: материнские антитела или воздействие вакцины или вируса дикого типа в прошлом (> 2 недель)
• Отрицательный:
  • Отрицательный результат на вакцину или вирус дикого типа
  • Слишком рано для обнаружения инфекции (10-14 дней до сероконверсии)
  • Несоответствие (подтип или клад) между вирусом, используемым в анализе, и вирусом, инфицирующим свинью

Сценарии

Свиньи на доращивании с чиханием и респираторными признаками (острыми или хроническими):

• Соберите 2-4 образца ротовой жидкости из группы и протестируйте с помощью ПЦР
• Соберите 12 мазков из носа инфицированных свиней с клиническими признаками (имеют прозрачные выделения из носа) и сделайте 3 пула по 4 образца в каждом, протестировав с помощью ПЦР
• Секвенируйте один положительный образец ПЦР, чтобы лучше определить кластер/клад

Определение времени воздействия и возможной необходимости вакцинации:

• Соберите образцы у 10–15 свиней в возрасте 3, 6, 9 и 12 недель
• Два подхода к сбору:
• o Поперечный срез — соберите образцы у разных возрастных групп одновременно (быстрее получить результаты).
• o Продольный — соберите образцы у одних и тех же свиней в течение времени (результаты более точные).
• Тестирование образцов сыворотки с помощью ИФА.
• Соберите 2–4 образца ротовой жидкости из группы и протестируйте их с помощью ПЦР
• Секвенируйте один положительный образец ПЦР из каждой возрастной группы, чтобы лучше определить кластер/оболочку