Ограничения метода ПЦР в диагностике РРСС

Для обнаружения РРСС наиболее широко используются два метода: ПЦР и ИФА (ELISA). В настоящей статье мы сконцентрируемся на ПЦР, методе, способном обнаружить вирус в, практически, любом материале. Он основан на полимеразной цепной реакции ДНК, или, в случае с РРССв, областей комплементарной ДНК (кДНК), фланкированных короткими последовательностями, с которыми специфичные ДНК-праймеры связываются на каждом ПЦР-цикле. Чувствительность и избирательность диагностических тестов, использующих ПЦР, зависят от того, насколько эти праймеры соответствуют своим целям и от термических циклов в процессе циклической амплификации. В идеале, они должны быть комплементарны только геному заданной разновидности вирусов, не связываясь ни с какими другими микробами или цепочками хозяйской ДНК, при этом, способными определять геномы всех штаммов или вариантов этих видов вирусов. Таким образом, они нацелены на наиболее консервативные области генома.

Вирус РРСС (РРССв) – один из самых сложных для разработки высокочувствительных и специфичных тестов ПЦР возбудителей. Известные в настоящее время вирусы РРСС относятся к двум видам: РРССв-1 и РРССв-2. Обе эти разновидности распространились по всему миру, при этом, РРССв-1 доминирует в Европе, а РРССв-2 – в Америке и Азии. Можно предположить, что генетическое разнообразие доминирующей разновидности РРССв выше, чем таковое вида с меньшей превалентностью. На практике, ПЦР-тесты, используемые, например, в Европе или Америке, могут быть более валидированы и лучше приспособлены к выявлению РРССв-1 или РРССв-2, соответственно. В результате, некоторые штаммы менее распространенных разновидностей на данной территории, или континенте, могут остаться незамеченными, а их роль в патогенезе РРСС – недооцененной. Это особенно важно, если речь идет о фермах, где РРССв-1 и РРССв-2 циркулируют совместно. Огромная генетическая изменчивость вирусов РРСС требует постоянного обновления последовательностей ПЦР-праймеров и зондов, чтобы поспеть за непрестанной эволюцией вируса и за появлением совершенно новых генетических вариантов. Особенно это относится к РРССв-1, чья крайняя генетическая изменчивость, вкупе с малодоступностью референсных вирусов из России, Беларуси и Украины представляют угрозу в плане нарушения чувствительности имеющихся на рынке комплектов ПЦР-тестов к Восточноевропейским генетическим подтипам РРССв-1.

В настоящее время такой вариант, как ПЦР в реальном времени, используется для, преимущественно, повседневной диагностики. Существует несколько методов ПЦР в реальном времени, отличающихся по своим принципам, но наиболее широко применяемым из них является метод с использованием так называемых TaqMan-зондов. TaqMan-зонд – это короткая область ДНК (олигонуклеотид), помеченная флуорофорами, которая связывает ДНК-мишень между фланкирующими праймерами. Если связывание произошло, зонд в лизирует в процессе полимеризации ДНК и флуоресцентное свечение регистрируется оборудованием. Особенно ПЦР в реальном времени подходит для мультиплексирования диагностических мишеней. Это означает, что одной ПЦР-реакцией (или одним тестом) можно выявить 2-3 различных патогена – по флуоресцентному свечению 2-3 различных красителей. Таким образом, одновременно обе разновидности РРССв могут легко быть обнаружены и дифференцированы в пробах, полученных от одного животного, из станка или со всей фермы.

Расшифровка результатов ПЦР обманчиво проста. Ветеринарные специалисты должны быть в курсе некоторых ограничений данного метода и быть в состоянии критично подходить к расшифровке результатов. Например, положительный результат ПЦР подтверждает присутствие полинуклеотида-мишени (т.е., РРССв) в пробе. Тем не менее, этот результат не доказывает, что в пробе содержится патогенный вирус. ПЦР в реальном времени позволяет квантифицировать вирус в пробе. Ее результаты выражаются в виде «порогового цикла» (Пц). Это первый цикл, на котором зафиксировано флуоресцентное свечение из реакционной пробирки. Чем ниже порядковое число цикла, тем выше число копий ДНК-мишени (читай, число копий вируса). Например, проба с Пц 20 может считаться в высокой степени положительной, а проба с Пц 35 – в низкой степени положительной. Тем не менее, в некоторых случаях флуоресценция обнаруживается только лишь на очень поздних циклах ПЦР в реальном времени, т.е., >38. Как такие высокие значения могут быть истолкованы? К несчастью, не всегда такой результат отражает присутствие очень небольшого количества копий вируса в образце. Эти, так называемые, «засони» могут быть результатом самопроизвольного выхода зонда из строя в результате большого числа термальных циклов ПЦР, что будет выглядеть как энзимный нуклеозис, вызванный ДНК-полимеразой. Стало быть, такое может произойти даже при отсутствии нуклеиновой кислоты вируса в пробе. Правильная интерпретация «засонь» при мониторинге свободных от РРССв популяций имеет важнейшее значение. Должна проводиться повторная диагностика, включая ИФА (ELISA). К несчастью, некоторые европейские диагностические лаборатории не предоставляют клиентам точные значения Пц при ПЦР в реальном времени. Вместо этого, результаты показываются как положительные или отрицательные. Полезность таких отчетов для практических специалистов весьма ограничена, а в некоторых случаях они могут стать причиной принятия неправильных решений в плане схем борьбы с РРССв.

Практические соображения

• Ни один из современных методов ПЦР не способен выявить все вируса РРСС.
• Отрицательный результат ПЦР-анализа нескольких случайным образом забранных на ферме проб не доказывает отсутствие на ней РРССв-инфекции.
• Положительный результат ПЦР доказывает присутствие в образце нуклеиновой кислоты РРССв, но не его, вируса, инфективность.