Практические рекомендации по сбору ротовых жидкостей

Недавние пандемии (COVID-19 у людей и африканская чума у свиней) показали, что систематический сбор данных о здоровье населения/поголовья необходим для понимания ситуации и разработки эффективного ответа. Сбор данных о здоровье у свиней является проблемой, так как клинические признаки очень разнообразны, а тестирование/отбор образцов у каждого животного достаточно дорого. Напротив, исследования на основе ротовых жидкостей просты, точны и экономически выгодны.

Ротовые жидкости собираются от каждого животного или от группы животных в станке с помощью подвешенной хлопковой веревки, животные кусают/жуют веревку и затем с нее собирают ротовые жидкости. Как оказалось, более 23 патогенов свиней вырабатывают определяемый уровень нуклеиновой кислоты и /или антител в ротовых жидкостях, включая наиболее значимые для здоровья свиней (н-р, африканская чума свиней, классическая чума свиней, ящур, грипп типа А, ЦВС-2 и РРСС). В Северной Америке ротовые жидкости широко используются для мониторинга поголовья, н-р, в период между 2010 и 2019 годами Ветеринарная диагностическая лаборатория Государственного университета Айовы провела примерно 1,4 млн. тестов по образцам ротовых жидкостей.

Сначала главное:

1. Каковы ваши долгосрочные цели в отношении здоровья? Как исследование поможет вам достичь ваших целей?
2. Understand the oral fluid collection process. Many videos on oral fluid collection are available online.

Сбор ротовых жидкостей:

1. Составление плана. Подготовьте необходимые материалы (веревка, резак, пробоотборные трубки и т.д.). Учитывайте биобезопасность, т.е. не переносите материалы между корпусами.
2. Собирайте образцы рано утром. Свиньи более активны утром. Если используется график кормления, собирайте образцы до кормления.
3. Используйте психологию свиней. Когда вы первый раз применяете веревку, дайте животным чуть больше времени, чтобы они привыкли и поняли, что им нужно делать (примерно 45 минут). Если свиньи боятся висящей веревки, положите ее (длина 1 метр с узлом на конце каждой веревки) на пол примерно на 30 минут. Как только они начнут играть с веревкой на полу, отведите свиней к месту, выбранному для подвешивания веревки, медленно волоча ее (волочите по полу, и свиньи пойдут), затем подвесьте новую веревку, чтобы свиньи начали ее жевать. Обратите внимание, что нанесение ароматизаторов на веревку малоэффективно.
4. У кого отбирать образцы? У поросят до отъема отбираются семейные ротовые жидкости (свиноматка и поросята). Индивидуальный отбор ротовых жидкостей или у свиней в одном станке можно проводить у животных старше или в возрасте 21 дня, включая свиноматок группового содержания. Сбор ротовых жидкостей у индивидуально содержащихся хряков и свиноматок может проводиться, но требует тренировки (см №3) и обычно не практично на крупных коммерческих фермах.
5. Следуйте заведенному порядку работы. Подвешивайте веревку в одном и том же месте в одно и тоже время для выработки привычки. Свиньи быстро усвоят процесс и будут точно знать, что делать при последующих отборах образцов. Как только процедура будет внедрена, время на сбор образцов можно сократиться до 20 минут. Не оставляйте веревку в станке на длительное время (часы), так как (а) образец будет потерян, так как веревка высохнет; (б) свиньи сильные и порвут веревку; (в) свиньям наскучит веревка, и они будут ее игнорировать.
6. Избегайте чрезмерного загрязнения образцов. Установите нижнюю границу висящей веревки на высоте лопаток свиней, чтобы она не касалась пола. Органический материал не оказывает прямого негативного воздействия на результаты теста (ОТ-ПЦР или ИФА), но чем чище ротовые жидкости, тем легче пипетировать и обрабатывать образцы в лаборатории.
7. Для каждого образца используйте отдельный чистый пластиковый пакет и трубку. Для сбора образцов поместите мокрую веревку в пластиковый пакет, отожмите жидкость, затем поместите образец в контейнер (заранее пронумерованный). После того как образец собран, снимите и уберите веревку, чтобы она оставалась для свиней в новинку (опять же, чтобы свиньям она не наскучила).
8. Будьте осторожны с образцом. Сразу же после сбора охладите образец (4°C), поместив его на лед или в холодильник. Подсчеты, произведенные на основе информации от Prickett и др., (2010) оценивают период полужизни РНК вируса РРСС в ротовых жидкостях примерно в 13 часов при 30°C, примерно 42 часа при 20°C и ≥ 14 дней при < 10°C. Антитела к вируса РРСС не были обнаружены в ротовых жидкостях после примерно 72 часов при температуре 30°C.

Применение исследований:

1. Сколько образцов отбирать и как часто? Всем приходится считаться с бюджетом. Даже в этом случае, всего лишь несколько образцов (2-4), отобранные в каждом корпусе (или помещении) через определенные промежутки времени (каждые 2-4 недели) предоставят убедительную картину касательно здоровья поголовья в зависимости от его продуктивности (Фото 1).
2. Составьте план для оценки данных исследования по истечению времени. Например, статистический контрольный график.
3. Используйте «фиксированную выборку» в корпусе для достижения максимального результата. Разъяснения по «фиксированной выборке» в корпусе или на площадке доступно в интернете:
   1. Отбор образцов на английском
   2. Отбор образцов на испанском
4. Ожидайте неожидаемое. Составьте план подтверждения или опровержения неожиданных результатов, н-р, повторное тестирование в двух экземплярах, повторный отбор образцов, тестирование с помощью другого метода.
5. Помните о естественном течении болезни, чтобы составить план. Тесты на нуклеиновые кислоты выявят наличие вируса на ранней стадии, а тестирование на антитела выявят результативный и расширенный иммунный ответ. Оба метода лучше работают вместе, например, при выходе животных с

   Другие идеи:

1. Зебры и лошади…похожи, но не оно и тоже. Образцы, которые кажутся схожими с ротовыми жидкостями, н-р, щечные или носовые мазки, могут не предоставить такой же уровень выявления по прошествии времени. Примеры гриппа типа А, ящура, вируса Сенека А и вируса РРСС представлены в Таблице 1.
2. Не объединяйте образцы ротовых жидкостей и не переносите веревки из станка в станок. Вместо улучшения процесса выявления вы можете получить ложные результаты.
3. Избегайте замораживания-оттаивания и/или резких перепадов температур. Антитела могут выдержать несколько циклов замораживания-оттаивания, но нуклеиновые кислоты не могут. Если один образец используется для нескольких тестирований, лучшее – разделить образцы на несколько аликвот и использовать одну аликвоту на тестирование. На ферме не храните образцы в саморазмораживающихся холодильниках, так как цикл разморозки может повредить нуклеиновым кислотам. В лаборатории разморозка ротовых жидкостей при температуре 4°C (не при комнатной температуре) показала себя как оптимальной для выявления РНК вируса РРСС (Weiser и др., 2018).

Таблица 1 Сравнение выявления нуклеиновых кислот в ротовых жидкостях и индивидуальных щечных или носовых мазках.

nd = нет данных.

^aПоложительный уровень (средний), рассчитанный на основе ротовых жидкостей, отобранных в станке и индивидуальных щечных мазков. Данные получены от Hole и др., (2019); Pepin и др., (2015); Romagosa и др., (2012); Senthilkumaran и др., (2017).