0
Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) является одним из наиболее распространенных диагностических инструментов, применяемых сегодня в свиноводческой медицине. Он используется не только в диагностических целях, но и как средство повышения биобезопасности путем эпиднадзора и мониторинга заболеваний. Таким образом, очень важно понимать преимущества и недостатки такой технологии при интерпретации результатов. Также важно помнить, что хотя одна и та же технология используется для разных патогенов, должны быть различия в интерпретации этих результатов.
Информация об анализе
Анализ ПЦР предназначен для обнаружения генетического материала (ДНК или РНК) бактерий или вирусов. Процесс начинается с выделения ДНК или РНК из образца, который затем подвергается тепловым циклам амплификации. Если целевым материалом является РНК, первым шагом будет преобразование РНК в ДНК (технически это называется кДНК). Термические циклы предназначены для создания трехэтапного процесса: 1) денатурации, 2) отжига и 3) удлинения, что приводит к дублированию материала ДНК, присутствующего в образце. Таким образом, для каждого цикла (1 Ct), предполагая 100% эффективность, ДНК будет в два раза больше. Затем целью будет продолжение процесса амплификации до тех пор, пока не будет обнаружено достаточное количество ДНК для того, чтобы образец дал положительный результат, или до 30-40 циклов в зависимости от конкретного используемого анализа.
Схематический механизм ПЦР.
Процесс экстракции является важным этапом анализа ПЦР, поскольку он влияет на количество и качество генетического материала в тестируемом образце. Крайне важно использовать правильный процесс экстракции для тестируемого типа образца (сыворотка, ротовая жидкость, ткань и т. д.). Шаг 2 процесса амплификации (процесс отжига) требует использования праймеров, которые представляют собой короткие фрагменты последовательности ДНК, специально предназначенные для прикрепления и репликации конкретной генетической последовательности целевого патогена. Для патогенов, которые постоянно эволюционируют генетически (например, вирус РРСС), эти праймеры необходимо периодически обновлять, чтобы гарантировать обнаружение новых штаммов.
Отсечка цикла анализа (обычно около 30-40) устанавливается с учетом того, что если процесс амплификации будет продолжаться, в конечном итоге анализ станет положительным просто из-за спонтанного отжига и удлинения, которые начнут происходить. Это говорит о том, что слабые положительные результаты, высокие значения Ct, близкие к пороговому значению, требуют особого внимания при интерпретации результатов, особенно в конце вспышки.
В свиноводстве используются два разных метода ПЦР. Традиционная ПЦР на основе геля и более современная ПЦР в реальном времени. Оба анализа работают одинаково, полагаясь на амплификацию ДНК или РНК. Разница заключается в том, что анализ на основе геля «считывается» только один раз в конце анализа, тогда как при ПЦР в реальном времени результаты анализа «считываются» после каждого цикла. Преимущество ПЦР в реальном времени заключается в том, что она позволяет получать количественные/полуколичественные результаты.
Группировка образцов для анализа
Анализы ПЦР обладают большой способностью обнаруживать небольшие количества генетического материала в образцах (аналитическая чувствительность) благодаря процессу амплификации генетического материала в образце. Это дает возможность оценить несколько образцов с помощью одного анализа (объединения). Важно помнить, что объединение по определению приведет к разбавлению оцениваемой пробы. Это не должно быть проблемой, когда ожидаемая концентрация конкретного возбудителя высока (особенно при ранней вспышке болезни). Объединение может быть проблемой, когда концентрация патогена в положительном образце низка, например, в конце вспышки заболевания или в образце, в котором ожидается, что он уже был разбавлен (жидкости ротовой полости).
