0
Сегодня, несмотря на описанные попытки достижения приемлемой репродуктивной способности и многоплодия после ИО, криовыживаемость сперматозоидов хряка все еще остается стабильно низкой вследствие их повреждения в процессе обработки относительно старым методом, который отнимает много времени (около 8-9 ч), является дорогостоящим (требует охлаждения центрифугами и т.д.) и выделяет мало доз из эякулята (этих доз часто достаточно только для 5-8 свиноматок, на 2 ОИ за течку). Количество рождающихся поросят при этом еще ниже, чем при использовании охлажденной или необработанной спермы, учитывая тот факт, что период сохранения жизнеспособности спермиев, место хранения и близость к овуляции вместе работают против положительного результата. Все это не делает замороженную сперму хряков хорошей альтернативой для свиноводства, тем не менее, это необходимо для банкирования генной информации и ее экспорта. В настоящей статье представлена альтернативная схема обработки спермы путем ее заморозки, основанная на биологических характеристиках эякулята, где его часть с пиковой концентрацией спермиев, лишь 10 мл, используется для замораживания в небольших дозах (0,5 мл каждая), в то время как остальная часть эякулированных спермиев (более 75%) используется для рутинного производства жидких спермодоз. Таким образом сочетается производство и банкирование. Репродуктивная способность/многоплодие этих небольших замораживаемых-размораживаемых доз является приемлемым при глубоком внутриматочном ИО во время спонтанной течки.
Изучение эякулята
Эякулят хряка состоит из трех различных фракций, видимых при сборе вручную: предсеменная фракция (водянистая, с небольшим количеством гелеподобных сгустков, без спермиев, около 10-20 мл), фракция с высокой концентрацией спермиев (более плотная, содержащая наибольшее количество сперматозоидов, без гелеподобных сгустков, объемом 30-50 мл), и последняя фракция (снова становится водянистой, заканчивается гелеподобными сгустками, объемом 150-200 мл). Проведенные нами исследования показали, что сперматозоиды, содержащиеся в первых 10 мл фракции высококонцентрированной спермы (называемых также фракцией с пиковой концентрацией, содержащей около 15-20% всех сперматозоидов, Рис. 1), были более устойчивыми к обработке (от разбавления до охлаждения) и криоконсервации, чем сперматозоиды, содержащиеся в остальной части эякулята. Считается, что тот факт, что первые сперматозоиды находятся в особых секретах (придатка яичка/простаты), в состав которых входят белки, определяющие фертильность, обусловливает увеличение устойчивости к обработке.
Рисунок 1: Стандартный эякулят хряка представлен тремя различными фракциями (PSF, РВСН и PSRF) в зависимости от концентрации сперматозоидов в числе других параметров (здесь показано красной линией). Пиковая концентрация сперматозоидов обычно содержится в первых 10 мл фракции с высокой концентрацией спермиев. При заморозке такое количество спермы данной фракции может дать 20 доз для ОИ посредством глубокого внутриматочного искусственного осеменения, в то время как остальная часть эякулята (зачастую этой же фракции) может обеспечить достаточно спермы для 25 стандартных доз семенной жидкости для искусственного осеменения.
Можем ли мы упростить протокол замораживания?
Обычное замораживание использует весь объем высококонцентрированной спермы, элиминируя семенную плазму при помощи разбавления и центрифугирования в охлаждаемых центрифугах. Затем осадок сперматозоидов вновь разбавляется, охлаждается и замораживается, часто в пробирках среднего размера (2,5 мл) или плоских пакетах объемом 5 мл (см. Рис. 2). Спермодозы обычно содержат по 5 миллиардов сперматозоидов. Таким образом, из одного эякулята можно получить максимум 16 доз для цервикального ИО (например, максимум 8 свиноматок, 2 ИО/течка). Мы сравнили процесс и результат замораживания спермы высококонцентрированной фракции (контроль) с процессом и результатом замораживания спермы с пиковой концентрацией (первые 10 мл высококонцентрированной фракции) посредством традиционного замораживания (ТЗ) в сравнении с упрощенным процессом (УЗ). Сперма с пиковой концентрацией была обработана в концентрированном виде (0,9 млрд. сперматозоидов на дозу) для последующего использования в глубоком внутриматочном ИО (1-2 дозы в период течки, чего должно быть достаточно для 10 свиноматок). Сначала клетки спермы с пиковой концентрацией находились в их семенной плазме в течение 30 мин, затем без центрифугирования (т.е. без удаления семенной плазмы), они смешивались с растворителем, состоящим из лактозы и яичного желтка (LEY) и охлаждались до +5°C в течение 1,5 ч, после чего смешивались с LEY и глицерином (3%) и пастой Orvus ES Paste и упаковывались в плоские пакеты по 0,5 мл (см. Рис. 2). Во всех случаях замораживание проходило со скоростью 50°C/мин. Вся «упрощенная» процедура (УЗ) длилась 3,5 часа по сравнению с контролируемой «традиционной заморозкой» (ТЗ), которая продолжалась 8 часов. В результате криовиживаемость была одинаково хорошей (выше 60% обработанных клеток).
Рисунок 2: Схематическое изображение основных различий между пластиковыми мини-пробирками объемом 0,25 мл и плоскими пакетами с одним (5 мл) или несколькими отделениями (0,5-0,7 мл)
Каковы преимущества?
Их несколько: использование подобного упрощенного, укороченного протокола позволяет отказаться от необходимости использования дорогостоящих охлаждающих центрифуг. Кроме того, вариации между хряками уменьшаются при использовании сперматозоидов первых 10 мл высококонцентрированной фракции, которые не только являются «лучшими» сперматозоидами для криоконсервации, но оказываются частью спермы той фракции, где подтверждено содержание белков определяющих уровень фертильности. Наконец, процедура позволяет производить дополнительную обработку остальной части собранных сперматозоидов (75-80% от общего количества спермиев), а это составляет примерно 25 спермодоз для ИО (Рис. 1). Таким образом, этот упрощенный протокол должен быть интересной альтернативой для племенного разведения посредством ИО, где один и тот же эякулят – замороженная семенная жидкость хряка – используется как для банкирования генов, так и для пополнения численности поголовий или коммерческого распространения наряду с традиционным производством спермодоз для искусственного осеменения, использующим остальную часть эякулята. Подобные процедуры не нарушат рутинной обработки хряков или их эякулятов.
Однако являются ли столь малые дозы (0,5 мл, 500 млн. смерматозоидов) фертильными?
Да, они приемлемо фертильны, даже после единичного глубокого внутриматочного искусственного осеменения во время спонтанной течки. Двойные глубокие внутриматочные осеменения (24 и 36 ч после установления течки), сделанные 120 свиноматками (после одного опороса) спермой с пиковой концентрацией, замороженной как описано выше (УЗ), привели к 42% опороса в среднем с 8 живыми поросятами в каждом помете. Использование дополнительных доз семенной жидкости (2,3 х 109 сперматозоидов) привело к 80% опороса с 13 живыми поросятами на помет (М. Валлгрен, неопубликованные результаты). Несмотря на то, что это не является альтернативой для вытеснения коммерческого использования семенной жидкости, эта процедура замораживания является хорошей альтернативой для банкирования генов и проверок биологической безопасности без нарушения коммерческого производства жидких доз для ИО или вмешательства в работу с хряками.