0
Тестирование нуклеиновых кислот стало стандартом для установления наличия патогенов в диагностических образцах. Обычной процедурой тестирования нуклеиновых кислот, используемой в диагностических и исследовательских лабораториях, является полимеразная цепная реакция или ПЦР. ПЦР представляет собой пошаговую процедуру, которая амплифицирует мельчайший фрагмент ДНК до такой степени, что он становится обнаруживаемым либо в виде полосы на гелевой полоске, либо в виде обнаруживаемого машиной флуоресцентного сигнала, и ее можно провести за несколько часов. Для хорошей работы ПЦР требуются значительные затраты на специализированное оборудование, такое как термоциклеры, специализированную лабораторию и обученный и опытный персонал.
Что такое LAMP?
Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) стала простым, быстрым, чувствительным и точным методом обнаружения и амплификации ДНК/РНК, не требующим сложного оборудования и относительно недорогим. Реакцию проводят в одной микроцентрифужной пробирке. Необходимым оборудованием для простой LAMP является пипетка, одноразовые пипетки и нагревательный блок для сухой ванны. В качестве источника тепла может быть достаточно водяной бани, обычного инкубатора или даже термоса с горячей водой, но для облегчения санитарной обработки лаборатории нуклеиновых кислот весьма желателен сухой блочный нагреватель (рис. 1).
Рисунок 1. Нагреватель блока сухой ванны для микроцентрифужных пробирок – подходит для LAMP. Источник: Thermo Fisher Scientific Inc.
При типичном применении LAMP смесь в пробирке будет содержать:
- Шесть фрагментов ДНК, называемых праймерами, которые соответствуют обнаруживаемой последовательности ДНК.
- Специфический фермент-полимераза (например, ДНК-полимераза BST)
- Буферы
- Вспомогательные реагенты
- Индикаторный краситель (индикатор pH или прямой краситель ДНК).
- Обратная транскриптаза для РНК-вирусов
- Исследуемый образец.
Эту смесь инкубируют при 60-65°С в течение 30 минут. Если в образце присутствует ДНК, соответствующая праймерам, конструируется серия петель ДНК в форме гантелей. По мере протекания реакции амплификации петли становятся более сложными и многочисленными (рис. 2).
Рисунок 2. Формирование петли ДНК в полимеразной реакции LAMP. Источник: Alhassan et al. 2015.
В результате полимеразной амплификации в качестве побочного продукта образуется пирофосфат магния, который вызывает помутнение (мутность) пробирки. Индикаторные красители, которые связываются с ДНК напрямую, дают флуоресцентный сигнал в видимом спектре или УФ. В одной системе LAMP используется индикатор рН фенолового красного цвета, который меняет цвет с розовато-красного на желтый.
На рис. 3 показан результат LAMP-теста на африканскую чуму свиней (АЧС). Пробирка А содержала экстракт селезенки свиноматки, павшей от АЧС. Высокое содержание ДНК вируса дает непрозрачный желтый цвет. Пробирка B представляла собой мазок ротовой жидкости с типично более низкой вирусной нагрузкой АЧС от той же свиноматки. Мутность в пробирках А и В определяется затемнением фоновой линии. От C до F - подозрительные и отрицательные трубки.
Рисунок 3. Микроцентрифужные пробирки, полученные в результате тестирования метода LAMP на месте в случае АЧС. A: селезенка от мертвой свиноматки, B: ротовая жидкость той же свиноматки, что и A, другие: подозрительные и отрицательные ротовые жидкости.
Есть несколько вариаций реакции LAMP в качестве тематического виджета. Тест можно применять в закрытых 96-луночных микропланшетах с колориметрическими или флуоресцентными красителями или мерами мутности для получения количественного и автоматизированного результата. Фотоэлементы с фильтрами в нагревательном блоке и подходящий светодиод также могут автоматизировать полуколичественное считывание флуоресценции микроцентрифужных пробирок в режиме реального времени. Спектрофотометрия камеры мобильного телефона может разрешить подозрительные пробирки в бинарном логическом «да/нет» в некоторых случаях, когда человеческий глаз не может полностью разрешить дилемму.
Реакция LAMP может быть проведена на месте в полевых условиях для практических результатов с минимальным временем ожидания. Наша лаборатория разработала и проверила недорогие анализы LAMP (с нуля и из «наборов») для классической чумы свиней (КЧС), цирковируса свиней 2 (ЦВС2) и АЧС (как указано выше) в качестве подтверждения концепции (для КЧС), что можно довольно дешево проверить партию племенных животных на инфекцию с помощью LAMP-тестирования.
Преимуществами LAMP являются быстрые результаты испытаний, минимальная потребность в обучении, небольшие инвестиции в оборудование, небольшие размеры лаборатории и низкая стоимость образца в целом. Хотя стоимость может различаться, стоимость LAMP обычно составляет примерно половину стоимости ПЦР и дополнительно снижается для простых матриц, где этап выделения нуклеиновой кислоты не требуется. Лаборатории, которые хотят инвестировать в разработку LAMP с нуля с относительно дешевыми реагентами и собственными наборами праймеров, потенциально могут избежать встроенной более высокой стоимости готового к использованию набора, но столкнутся с расходами, связанными с разработкой, проверкой и сертификацией.
Чувствительность и специфичность LAMP сравнима с ПЦР, результаты можно получить через 30 минут. В некоторых юрисдикциях одобрены коммерческие наборы для тестирования LAMP на АЧС и Covid-19 человека.
Недостатки LAMP могут заключаться в незнание его некоторыми академическими и исследовательскими работниками и некотором скептицизме в отношении метода. LAMP требует 6 (до 8) праймеров для каждого обнаруживаемого гена, а создание праймеров является более сложной задачей, чем обычная ПЦР, но доступны онлайн-инструменты. Для сильно мутабельных РНК-вирусов, таких как РРСС, может потребоваться несколько наборов праймеров в смеси, но это не исключает ее полезности. LAMP действительно генерирует много ДНК, и пробирки с положительным результатом, как правило, не следует открывать после теста, чтобы избежать лабораторного загрязнения. Ампликоны LAMP трудно поддаются последовательному секвенированию, и лаборатории может потребоваться организовать обычную ПЦР или другие методы для LAMP-положительных образцов, когда требуются генные последовательности.
Можно легко представить себе применение LAMP в корпусах, в пунктах сбора животных и на бойнях, а также в примитивных и удаленных условиях, где нельзя брать чувствительное и дорогое оборудование. Там, где сложное оборудование или даже электричество недоступны, а бинарные ответы «да/нет» необходимы для действий человека в режиме реального времени на месте, LAMP может обеспечить последовательные действия. Низкая стоимость и отсутствие потребности в оборудовании несколько препятствовали распространению LAMP, поскольку компании и университетские лаборатории могут предпочесть дорогостоящее физическое оборудование, а предельная отдача от инвестиций может быть более важной, чем фактическая стоимость платных медицинских услуг.
По мере того, как мир движется к контролю и ликвидации важных эндемических трансграничных болезней, таких как африканская чума свиней (АЧС), РРСС и классическая чума свиней (КЧС), доступность быстрого, удобного и экономичного теста может оказаться полезной.
«Возможно, быть слишком практичным — это безумие». - Мигель де Сервантес Сааведра (1547-1616), Дон Кихот.
