Секвенирование вируса РРСС его применение на практике

Репродуктивно-Респираторный синдром свиней (PRRS) по-прежнему является, безусловно, болезнью связанной с самым большим экономическим ущербом в свиноводстве, и уровень его контроля далек от удовлетворительного. Лучшее и более полное представление о разновидностях PRRSV и мониторинг циркуляции новых штаммов в определенной области/стране/континенте, безусловно, поможет ветеринарам и производителям реализовать программы контроля и, возможно, эрадикации (искоренения). Для этого секвенирование PRRSV стало доступно по всему миру, начиная с конца 1990 'годов в основном в Северной Америке, Европе и Юго-Восточной Азии.

Геном PRRSV (см. рисунок 1) представляет одноцепочечную молекулу РНК, что делает его склонным "делать ошибки" (в виде генетической мутации) во время репликации в хозяине. Эта "тенденция к ошибкам" является причиной наличия различных prrsv штаммов, каждый из которых уникален в своей собственной генетической последовательности. Отвечают ли различия последовательности за разное (клинико-патологическое? иммунологическое?) поведение " - по-прежнему является предметом обсуждения среди практиков и исследователей.

Основы секвенирования PRRS

Вирусное секвенирование производится на материалах ПЦР из полевых образцов (сыворотки, ткани, оральные жидкости). Чтение нуклеотидов осуществляется обычно из некоторых фрагментов генома вирусной РНК (см. рисунок 2) в целевых регионах – ORFs (открытая рамка считывания), а затем сравнивающих процент гомологии путем филогенетических анализов, выполняемых применением соответствующего программного обеспечения. Результат этого процесса возвращает степень сходства (гомологии) между различными штаммами PRRSV. С помощью графической визуализации программного обеспечения, а также дендрограммы (или" филогенетическое дерево"), определяют родство (или отсутствие родства) со ссылкой на вирусную последовательность (см. рисунок 3).

Геном PRRSV кодирует не менее дестяти ORF. Наиболее часто используемый для секвенирования – хотя они составляют только 4% и 3% всего генома соответственно - ORF5 (Кодировка негликозилированного белка Е) и ORF7 (кодирующий нуклеокапсид (N) белка). ORF5 представляет более переменную область, в то время как ORF7 представляет собой более постоянную область. Из-за этого та же степень вариации (т. е. 5% вариации), найденная в ORF7, более "драматична" – в плане генетической изменчивости-по сравнению с ORF5. Толкование сходства (т. е. вирусы связаны или нет) требует гораздо больше дополнительной информации, так как скорость генетических изменений может быть весьма вариабельной.

Чрезвычайно важно вести запись всех последовательностей, однозначно идентифицированных и аннотированных и тщательно зафиксировать дату, тип предприятия (ферма 1-2-3), движение животных, местоположение фермы (широта/Долгота GPS) и происхождение последовательности (Тип животного/ткань/образец). На сегодняшний день наш массив данных последовательностей PRRSV содержит более 1300 последовательностей ORF7, начиная с 2002 года. Для интерпретации и понимания различий еще более важно сопоставлять отдельные последовательности с клиническими случаями, характеризующимися количеством абортов у свиноматок и смертностью поросят перед отъёмом в типе 1 и уровень смертности в типах 2 и 3.

Практические вопросы

Часто задаваемые вопросы от ветеринаров и производственников:

• Представляют ли наблюдаемые генетические различия между последовательностями нормальную вариацию одноного штамма PRRSV в ферме / системе или они представляют собой несколько различных штаммов, присутствующих на ферме одновременно или за короткий промежуток времени?
• У меня сейчас" новая вспышка, вызвана новым штаммом или это рециркуляция?

Чтобы ответить на эти вопросы, мы должны договориться о принятой степени гомологии между двумя вирусными штаммами, собранными в течение определенного периода времени (12-24 месяцев?). Иными словами, сходство считается установленным при 97-98% гомологии последовательности или 2-3% разница. Это является общепринятым значением. Согласно моему опыту, довольно трудно увидеть изменение выше 2% в клинически стабильной закрытой популяции "(традиционный тип фермы с соответствующим движением животных), поскольку мы наблюдали получение" того же штамма " в течение периода до 3 лет в одном и том же клинически стабильном стаде. Напротив этого, каждый раз, когда мы замечали консистентную активность репродуктивно-респираторного синдрома свиней "нового" и филогенетически различных (90% гомологии или меньше) штамм восстанавливается. К сожалению, мы точно не знаем, являются ли эти большие различия, которые мы иногда наблюдаем, результатом внезапного изменения вируса/мутации (по моему личному мнению маловероятно) или внедрения нового штамма. Хорошо признан тот факт, что генетическое сходство / разнообразие никоим образом не предсказывает иммунологическое сходство (т. е. существование перекрестного иммунитета) и не позволяет предсказать внутреннеприсущей патогенности (не говорит о вирулентности определенного штамма).

Полностью расшифрованные последовательности генома, которые сегодня доступны (к сожалению, больше для научных целей, чем для повседневного использования в диагностике), безусловно, помогут ответить на этот вопрос.

Очень важно проанализировать новые последовательности PRRSV в сопоставлении с широким справочным набором, представляющим ферму, систему и регион, а также последовательности имеющихся коммерческих вакцин (это позволит провести различие между полевыми и вакцинными штаммами). На данный момент мы все еще используем набор программного обеспечения с открытым исходным кодом, управляемый университетом Падуи (Padova University), чтобы построить наши филогенетические деревья и сохранить их организованным в зависимости от движения свиней в нашей общей производственной системе. Мы могли бы также присоединится к двум другим "специальных компьютерных программ" (Биопортал университета Дэвиса Калифорнии и CLASSIFARM- PATH от IZSLER (Брешиа, Италия), что будет иметь гораздо больший набор последовательностей для сравнения. Это позволяет нам лучше понять PRRSV распространение в Италии и, возможно, в Евросоюзе.

Благодарность: Спасибо профессору Микеле Дриго (UNI-PD) за интересное обсуждение и рецензию этой публикации.